Fluorestsentsmikroskoop – definitsioon, tööpõhimõte ja kasutusalad

Fluoresentsmikroskoop on optiline mikroskoop, mis kasutab orgaaniliste või anorgaaniliste ainete uurimiseks fluorestsentsi ja fosforestsentsi. "Fluorestsentsmikroskoop" - mis tahes mikroskoop, mis kasutab pildi tegemiseks fluorestsentsi. See kehtib olenemata sellest, kas tegemist on lihtsama seadeldisega või keerukama konstruktsiooniga.

Enamik fluorestsentsmikroskoope, eriti neid, mida kasutatakse bioteadustes, on epifluorestsentse ülesehitusega, nagu on näidatud joonisel. Erutuslainepikkusega valgus valgustab proovi läbi objektiivi. Proovi poolt kiiratav fluorestsentsioon fokuseeritakse detektorile. Dikroiline valgusjaotur toimib lainepikkusespetsiifilise filtrina, mis laseb fluorestseeritud valguse läbi okulaari või detektorisse, kuid peegeldab ülejäänud ergutusvalguse tagasi valgusallika suunas.

Tööpõhimõte lihtsas keeles

Fluorestsents põhineb aatomite või molekulide võimel imada energiat (tavaliselt valgusena) ja seejärel kiirata tagasi madalama energia lainepikkusega valgust. Mikroskoobis kasutatakse ergutusvalguse (näiteks UV-, sinist või rohelise valguse) impulsse, mis panevad proovis olevad fluorestseeruvad molekulid eraldama iseloomulikku helendavat valgust. See helendus koosneb tavaliselt kindlatest lainepikkustest, mida eraldavad sobivad filtrid ja mille miski muu valgustus ei kata, võimaldades kontrastset ja spetsiifilist pildistamist.

Peamised komponendid

• Valgusallikas — tavaliselt kõrge intensiivsusega laagrid (HBO), halogeenid või tänapäevased LED-id ja laserid, mis annavad vajalikud ergutuslainepikkused.
• Ergutuse filtrid — valivad just selle lainepikkuse, mis ergutab fluorofoori.
• Dikroiline peegel (valgusjaotur) — suunab ergutusvalgust proovi ja laseb fluorestsentsivalgust edasi objektiivi poole.
• Emissiooni filtrid — lasevad läbi ainult fluorestsentsile iseloomuliku lainepikkuse, blokeerides ergutusvalguse.
• Objektiivid — eriline optika, sageli suure NA-ga, mis kogub nõrka fluorestsentsi efektiivselt.
• Detektorid — okulaarsilm, CCD-/sCMOS-kaamerad või konfokaalsüsteemides fotomultiplier-torud (PMT), mis muundavad valguse signaaliks.

Tüübid ja tehnoloogiad

• Laialt valgusväljaga (widefield) fluorestsentse mikroskoopia — sobib kiireks imagistikaks ja üldvaatluseks, kuid taustsignaal võib olla suur.
• Konfokaalne mikroskoopia — kasutab punktvalgustust ja pinhole´i, et vähendada tausta ja saada teravamaid optilisi lõike (optical sectioning).
• Two-photon (kahe footoni) mikroskoopia — sügavam sissetung koe sisse, väiksem fotokahjustus väljasel pinnal; kasulik elus kudede uurimisel.
• Töötava raku/ajapõhise (time-lapse) imaging — võimaldab jälgida dünaamilisi protsesse reaalajas, kui kasutatakse õigeid fluorofoore ja õrna valgusintensiivsust.

Kasutusalad

• Rakubioloogia: organellide, valkude ja geeniekspressiooni paiknemise määramine (nt GFP-sildistused).
• Patoloogia: histoloogilised värvid ja immunofluorestsents haigusproovide analüüsiks.
• Neuroteadused: närvirakkude ja sünapside kaardistamine, kaltsiumi-jälgimine.
• Keskkonnateadus: mikroorganismide jaos või saasteainete fluorestsentsanalüüs.
• Meditsiiniline diagnostika: nakkushaiguste avastamine, vähirakkude markerid.

Eelised ja piirangud

• Eelised: kõrge spetsiifilisus märgiste kaudu, võimalus mitme markeri korraga (multisünt), suuri detaile kuni molekulaarskaalal;
• Piinangud: fotobleaching (fluorofooride pimedaks jäämine), autofluorestsents koekoes (tausthäired), spektriline kattuvus erinevate fluorofooride vahel ning piiratud lahutusvõime võrreldes näiteks elektronmikroskoopiaga.

Proovide ettevalmistus ja fluorofoorid

Õige proovivalmistus on edu alus: sobivad fikseerimis- ja läbitungivad meetodid, blokeerimine mittespetsiifiliste seoste vähendamiseks ning optimeeritud värvimistingimused. Levinud fluorofoorid on DAPI (tuuma värvimiseks), FITC, TRITC, ja pärsitud valgu markeeringud nagu GFP ja selle derivaadid. Valiku tehes tuleb arvestada ergutus- ja emissiooni lainepikkusi ning mikroskoobi filterset-tüüpe.

Nõuanded praktikas

• Kasutage võimalikult sobivaid filterkomplekte, et vähendada spektrilist kattuvust.
• Vähendage valgusintensiivsust ja säritusaega, et minimeerida fotobleachingut ja fototoksilisust elusrakkudel.
• Kasutage korrektselt kalibreeritud detektoreid ja vajadusel pilditöötlust (deconvolution, spektriline unmiksimine) tausta vähendamiseks ja signaali eraldamiseks.
• Hooldage optikat ja filtreid tolmu ning õli eest — mustus mõjutab tugevalt signaali kvaliteeti.

Tulevik ja arengusuunad

Fluorestsentsmikroskoopia areneb edasi: superlahutusmeetodid (nagu STED, PALM/STORM) ületavad traditsioonilise optilise lahutusvõime piire, parandades molekulaarrakenduste võimalusi. Samuti kasvab koondtehnoloogiate (konfokaal + multi-photon + spektroskoopilised meetodid) ja andmetöötluse (masinõpe) roll, võimaldades keerukamate proovide kiiremat ja täpsemat analüüsi.

Kokkuvõtlikult: fluorestsentsmikroskoop on võimas tööriist nii põhi- kui rakendusuuringutes. Selle õige kasutus, sobivate fluorofooride valik ning proovide ettevalmistus on võtmetähtsusega usaldusväärsete ja informatiivsete tulemuste saavutamiseks.

Küsimused ja vastused

K: Mis on fluorestsentsmikroskoop?

K: Mida tähendab mõiste "fluorestsentsmikroskoop"?

K: Milline on enamiku bioteadustes kasutatavate fluorestsentsmikroskoopide ehitus?

K: Kuidas fluorestsentsmikroskoop valgustab proovi?

K: Kuidas tuvastab fluorestsentsmikroskoop proovi poolt kiiratud fluorestsentsi?

K: Milline on dikrootilise valgusjaoturi ülesanne fluorestsentsmikroskoobis?

K: Mis vahe on fluorestsentsi ja fosforestsentsi vahel?

Otsing