Fluorestsents: definitsioon, põhimõte ja peamised kasutusalad

Fluorestsents on valgus, mida teatud ained kiirgavad, kui nad neelavad valgust või muud elektromagnetilist kiirgust. Kõigepealt neelab aine energiat ja selle elektronid tõusevad kõrgemale energiaastmele; seejärel tagasipöördumisel kiirgab aine välja osa neeldunud energiast valgusena. Kui valgusallikas eemaldatakse, lakkab fluorestsentsi tekkimine — tegemist on ühe luminestsentsi vormiga.

Mis toimub aatomitasandil ja kuidas fluorestsents töötab

Protsess algab valguse (või muu elektromagnetilise kiirguse) neeldumisega, mille järel molekul liigub kõrgemasse energiaolekusse (tavaliselt eksiteeritud singuleeritud olekusse, tähistatud S1). Eksiteeritud olekus toimub kiire vibreeriv ja sisemine konversiooniline energiakaotus, mille tõttu väljuv kiirgus on tavaliselt madalama energia ehk pikema lainepikkusega kui neeldunud valgus — seda nähtust nimetatakse Stokesi nihkeks. Fluorestsents-protsessi iseloomustab ka lühike säriaeg (tavaliselt nanosekunditest mõnikümmend nanosekundit), mis eristab seda ~pikema~ kestusega fosforestsentsist (kus osalevad kolmanda spin-seisundiga tripletid ja emissioon võib kesta ms–s kuni sekunditeni).

Peamised omadused ja tegurid

Ekspitatsiooni ja emissiooni spektrid — iga fluoroforil on spetsiifiline neeldumis- (eksitatsiooni) ja välja kiirgumise (emissiooni) maksimumlainepikkus.
Stokes’i nihke suurus määrab, kui palju on emissioon nihkunud pikemale lainepikkusele võrreldes neeldumisega; suurem nihke vähendab instrumentaalset segamist.
Kvantarendlikkus (quantum yield) — suhe neeldunud footonite ja emiteeritud footonite vahel; suurem kvantarendlikkus tähendab eredamat fluorestsentsi.
Särelusaja pikkus (fluorestsentsi lifetime) — tüüpiliselt nanosekundid; oluline aeg-aegse (time-resolved) mõõtmise ja FRET-analüüside puhul.
Kvantsignaali nõrgenemine — fluorestsentsi võib pärssida quenching (näiteks hapniku mõju, pH muutus, kollisioonid või lähenevad doonor-akseptor interaktsioonid) ning püsiv valguskohver võib põhjustada photobleaching ehk pöördumatut heleduse kadu.

Mõned tuntud fluoroforid ja märksõnad bioteadustes

Biotööstuses ja laborites kasutatakse laias valikus fluorestseeruvaid värvaineid ja valgulärke, näiteks GFP (rohelise fluorestseeruva valgu) derivaadid, fluoresceiin, rhodamiin, Alexa-sarja värvid ja DNA-värvid nagu DAPI. Neid kasutatakse spetsiifiliste molekulide sildistamiseks ja jälgimiseks. Paljudel juhtudel kinnitatakse fluorestseeruv värvaine valgule või muule biomolekulile, et seda mikroskoobiga visualiseerida (valgu sildistamine on selle levinud näide).

Peamised kasutusalad

Bioloogia ja meditsiin: fluorestsentsmikroskoopia, konfokaalmikroskoopia, superresolutsioon-tehnikad, immunofluorestsents (antikehade abil märgistamine), FISH (fluorescence in situ hybridization) ja FRET (Förster resonance energy transfer) rakkude ja molekulide uurimiseks.
Laboratoorsed meetodid: fluorestsentsi spektroskoopia ja spectrofluorometerid annavad eksitatsiooni- ja emissioonispektrid, kvantarendlikkuse ja särelusaja mõõtmised; kasutatakse ka kõrget läbivoolu analüüsiks (flow cytometry).
Sensorid ja analüütika: keemilised ja bioloogilised andurid, mis mõõdavad ioonide (nt Ca2+ indikaatorid Fura-2, Fluo-4), pH muutusi või konkreetseid molekule fluorestsentsi muutuse kaudu.
Mineraloogia ja gemmoloogia: mitmed mineraalid ja kalliskivid fluoretsseeruvad UV-kiirguse all, seega kasutatakse fluorestsentsi nende identifitseerimiseks ja uurimiseks (mineraloogias, gemmoloogias).
Värvid ja valgusallikad: fluorestseeruvad pigmendid ja materjalid (näiteks fluorestseeruvad värvid) ning fluorestseeruvad valgustid ja luminofooridega lampide tehnoloogia, kus UV-kiirgus konverteeritakse nähtavaks valguseks.
Forensika ja turvalisus: bioloogiliste vedelike (veri, sperma) ja paberite/rahade autentsuse kontrollimiseks kasutatakse fluorestsentsi detekteerimist.
Tehnilised rakendused: fluorestsentsi kasutavad ka optilised markerid, anduri- ja diagnostikakomponendid ning mõnedes juhtudel ka juhusliku valguse visuaalseks efekti loomiseks disainiprindis ja turvakoodides.

Kasutamisel tähelepanu vajavad piirangud

Fluorestsents on võimas meetod, kuid sellega kaasnevad piirangud: autofluorestsents (näiteks kudede või materjalide omaenda taustvalgus) võib varjutada nõrka signaali; pH ja keskkonnatingimused mõjutavad värvaine omadusi; intensiivne UV- või sinine valgus võib põhjustada photobleaching’u. Ka ohutus — UV-valguse kasutamisel tuleb kaitsta silmi ja nahka.

Kokkuvõttes on fluorestsents mitmekülgne nähtus ja tööriist, mis põhineb energia neelamisel ja uuesti kiirgamisel. Seda kasutatakse nii teadusuuringutes, diagnostikas, tööstuses kui ka igapäevasemates rakendustes nagu fluorestseeruvad lambid, värvained ja biomolekulide märgistamine.

Endoteelirakud mikroskoobi all, kus on kolm eraldi kanalit, mis tähistavad spetsiifilisi rakukomponente

Küsimused ja vastused

K: Mis on fluorestsents?

V: Fluorestsents on valgus, mida teatud ained kiirgavad, kui nad neelavad valgust või muud elektromagnetilist kiirgust.

K: Mis juhtub, kui aine fluorestseerub?

V: Kui aine fluorestseerub, neelab ta kõigepealt energiat ja seejärel kiirgab valgust.

K: Kas fluorestsentatsioon jätkub pärast valgusallika eemaldamist?

V: Ei, fluorestsentatsioon lakkab esinemast, kui valgusallikas eemaldatakse.

K: Kas fluorestsentsi puhul on tegemist luminestsentsiga?

V: Jah, fluorestsents on luminestsents.

K: Kuidas on fluorestsentsi ajal kiirguva valguse lainepikkus ja energia võrreldav neeldunud valgusega?

V: Enamasti on fluorestsentsi käigus eralduv valgus pikema lainepikkuse ja väiksema energiaga kui neeldunud valgus.

K: Milline on näide üllatavast fluorestsentsi tüübist?

V: Üks üllatav fluorestsentsi tüüp on see, kui aine neelab ultraviolettvalgust, mida inimsilm ei näe, kuid annab välja nähtavat valgust.

K: Millistes valdkondades kasutatakse fluorestsentsi?

V: Fluorestsentsi kasutatakse paljudes valdkondades, näiteks mineraloogias, gemmoloogias, keemilistes andurites (fluorestentsspektroskoopia), värvainetes, bioloogilistes detektorites ja fluorestseeruvates valgustites.