Knockout-hiir: geneetiliselt inaktiveeritud mudelloom ja roll teaduses

Koputushiir on geneetiliselt muundatud hiir, mille puhul on üks või mitu geeni välja lülitatud geeni välja lülitamise teel. Seda nimetatakse ka inglise keeles knockout-hiireks ja see on oluline tööriist genoomi funktsioneerimise uurimisel. Knockout-hiirte abil saab otseseid seoseid tuvastada geeni puudumise ja muutunud raku-, organi- või organismitasandi fenotüübi vahel.

Knockout-hiired on olulised loomamudelid selliste geenide rolli uurimiseks, mis on sekveneeritud, kuid mille funktsioonid ei ole veel teada. Tehes konkreetse geeni hiirel inaktiivseks ja jälgides erinevusi normaalsest käitumisest või seisundist, saavad teadlased teha järeldusi selle tõenäolisest funktsioonist. Selliseid samme kasutatakse laialdaselt näiteks haigusgeenide uurimisel, ravimite sihtmärkide valideerimisel ja arengubioloogia põhiküsimuste lahendamisel.

Kuidas knockout-hiired valmivad

Traditsiooniline knockout-tehnika põhineb geeni sihtimise ja homologeense rekombinatsiooni kasutamisel embrüonaalsetes tüvirakkudes (ES-rakud). Üldised sammud on:

• sobi geeni "väljalülitamiseks" konstrueeritakse laboris (sissetungiv DNA-fragment, mis põhjustab geeni riknemist või asendamist);
• konstrukti viiakse ES-rakkudesse ja valitakse rekombinandid, kus konstrukt on genoomiga ühinenud;
• muundatud ES-rakud süstitakse hiirebalastidesse, et luua klore või mosaiikhiiri (chimeras);
• mosaiigid ristatakse edasiste põlvkondade saamiseks kuni mutant geen jõuab germijärglusse ja sellega paljundatakse line; ja
• põlvkondade analüüsiga hinnatakse fenotüüpe ja geeni mõju.

Lisaks traditsioonilisele meetodile on viimastel aastakümnetel laialdaselt kasutusele võetud ka Cre-Lox süsteemid tingitudeks (kudedespetsiifilised või ajapõhised väljalülitamised) ning CRISPR–Cas9 geeni redigeerimine, mis on kiirendanud ja lihtsustanud knockout- ja knock-in variantide loomist ning on võimaldanud paljudel juhtudel ka recordeerida knockoute teistes liikides nagu rotid.

Tüübid ja nüansid

• Konstitutiivne (püsiv) knockout – geen on kogu organismis pidevalt inaktiveeritud; sobib uuringuteks, kus geenifunktsioon ei ole kriitiline embrüogeneesis.
• Tinglik (conditional) knockout – geen lülitub välja ainult teatud kudedes või ajahetkel (tavaliselt Cre-Lox-põhised süsteemid); kasulik, kui geeni puudumine varases arengus oleks surmav.
• Väljaemaldus ja osaline knockout – mõnikord eemaldatakse ainult osa geenist või muudetakse regulaatorpiirkondi, et uurida spetsiifilisemaid efekte.

Rakendused teaduses ja meditsiinis

Knockout-hiiri kasutatakse mitmel põhjusel:

• mõõdetakse geenide rolli arengus, immuunsüsteemis, närvisüsteemis ja ainevahetuses;
• luuakse haigusmudelid inimhaigustele (nt neurodegeneratiivsed haigused, vähk, metaboolsed häired);
• hinnatakse ravimite sihtmärkide biologilist olulist mõju ja toksilisust;
• uuritakse geenidevahelisi interaktsioone ja molekulaarseid teid;
• käimas on suuremahulised geneetiliste ekraamide programmid, kus iga geen lülitatakse järjest välja, et kaardistada funktsioone (genoomi-funktsioneerimise projektid).

Piirangud ja tõlgenduse ettevaatused

Kuigi knockout-hiired on väga väärtuslikud, tuleb tulemusi tõlgendades arvestada mitmete piirangutega:

• kompensatoorne regulatsioon – teised geenid võivad osa funktsioonist üle võtta, peites nähtavaid efekte;
• taustsõltuvus – fenotüüp võib sõltuda hiire tõust ja geneetilisest taustast;
• embrüonaalne letalitus – mõnede geenide väljaütlemine põhjustab surma varases arengus, mistõttu otsekohe funktsiooni hinnata ei saa;
• off-target efektid ja kromosomaalsed muudatused, eriti kui kasutatakse kiireid redigeerimismeetodeid ilma põhjaliku kontrollita;
• eriolukordade ülekantavus – loomamudel ei pruugi alati täpselt peegeldada inimese bioloogiat.

Tehnoloogiline ajalugu ja areng

Esimese knockout-hiire lõid Mario R. Capecchi, Martin Evans ja Oliver Smithies 1989. aastal, mille eest nad said 2007. aastal Nobeli füsioloogia- või meditsiinipreemia. Üksikasjalik selgitus selle kohta, kuidas knockout (KO) hiired toodetakse, on esitatud 2007. aasta Nobeli füsioloogia- või meditsiinipreemia veebilehel. Alates sellest on tehnoloogia pidevalt arenenud: tingitud knockoute ja kiiremaid redigeerimismeetodeid (nt CRISPR–Cas9) on kasutusele võetud, mis on lihtsustanud ja kiirendanud nii hiirte kui ka teiste liikide, sealhulgas rottide, geneetilist modifitseerimist.

Eetika, regulatsioon ja intellektuaalomand

Knockout-eksperimentide puhul tuleb arvestada loomade heaolu ja eetikaga. Paljudes riikides reguleerivad teaduseeetika komiteed ja loomakaitse seadused loomkatseid; laborid järgivad sageli 3R-põhimõtteid (Reduce, Refine, Replace). Lisaks on mitmetes riikides eraettevõtted patenteerinud koputushiirte loomise tehnoloogia ja hiired ise. See on tekitanud arutelusid patendipoliitika, teaduse avatuse ja kommertsliku ligipääsetavuse üle.

Tulevik ja alternatiivid

Tulevikus on oodata täpsemaid redigeerimise vahendeid, paremat fenotüüpimise automatiseerimist ja suuremaid andmestikke, mis aitavad seostada geene haiguste ja füsioloogiliste protsessidega. Samal ajal arenevad ka alternatiivid, mis võivad vähendada loomade kasutust: in vitro mudelid, organoidid, arvutuslikud modelleerimised ja kõrgtehnoloogilised rakkude põhised ekraamid.

Kokkuvõttes on knockout-hiired võimas vahend biomeditsiinis, võimaldades selgitada geenide põhifunktsioone ja luua mudelid inimhaiguste uurimiseks, kuid nende tõlgendamisel tuleb arvestada tehniliste, bioloogiliste ja eetiliste nüanssidega.

Küsimused ja vastused

K: Mis on nokitsetud hiir?

K: Miks on knockout-hiired olulised?

K: Milliseid loomaliike kasutatakse knockout-katsetes?

K: Kes lõi esimese knock-out hiire?

K: Kust leida teavet selle kohta, kuidas KO-hiired toodetakse?

K: Kas KO-tehnoloogia aspektid on patenteeritud?

Otsing