Geeni knockout (KO): definitsioon, toimemehhanism ja kasutus
Geeni knockout on geneetiline meetod, mille puhul üks organismi geenidest lülitatakse välja või asendatakse sellega, mis ei tööta. Selle tulemuseks on geenist põhjustatud valgufunktsiooni puudumine või oluliselt vähenenud aktiivsus — see aitab uurida, mille eest antud geen organismis vastutab.
Organismid, nagu näiteks knockout-hiired, kasutatakse selleks, et õppida tundma geeni, mis on küll sekveneeritud, kuid mille funktsioon on teadmata või puudulikult teada. Teadlased teevad järeldusi erinevusest knockout-organismi ja normaalsete isendite vahel. Knockouti lühendiks on sageli KO.
Geeni knock-in on vastupidine termin. Seal lülitatakse geen sisse või sisestatakse toimiv geen, näiteks et parandada mutatsiooni või lisada märgistus (reporter), mis võimaldab geeni ekspressiooni jälgida.
Kuidas knockoute tehakse (lühike ülevaade)
- Homoloogiline rekombinatsioon — traditsiooniline meetod, mida kasutati palju hiiremodellide loomisel: konstrukti (sihtiva nukleotiidijärjestusega) viiakse emakasisestesse tüvirakkudesse, seejärel valitakse rakkudes korrektne asendusevent ning saadakse chimera‑isendid, kes kanduvad edasi.
- CRISPR/Cas9 — kaasaegne ja kiire tehnoloogia, kus lõigatakse DNA spetsiifilises kohas ja käivitatakse rikki minekuga seotud parandused, mis tekitavad geenis funktsionaalse kadumise (sageli sisse‑väljaviimise kaudu). CRISPR võimaldab ka sihtotstarbelisi knock-in muudetusi.
- Muud lähenemised — megaribonukleaasid, TALENid või retrotransposooni‑põhised meetodid; mõnikord kasutatakse RNA‑põhiseid meetodeid (nagu RNAi) geeni ajutiseks pärssimiseks — see on siiski knockdown, mitte täielik knockout.
Tüübid ja eripärad
- Konstitutiivne knockout — geen on inaktiveeritud kogu organismis alates varajastest arengustaadiumitest.
- Tõenduslik / koe‑spetsiifiline knockout — geen lülitatakse välja ainult teatud kudedes, kasutades näiteks Cre‑Lox süsteemi, mis võimaldab vältida embrüonaalset letalsust ja uurida koe‑spetsiifilist funktsiooni.
- Indutseeritav knockout — geen saab välja lülitada juhitavalt (nt tamoksifeeni või doxycycline abil), mis võimaldab ajastada geenifunktsiooni kadumist.
- Mosaik/mittevõrdne knockout — eriti CRISPR kasutamisel võib osadel rakkudel geen jääda aktiivseks (mosaik), mis nõuab täpset isendite isoleerimist ja karakteriseerimist.
Kasutusalad
- geenifunktsiooni määramine ja äratundmine;
- haiguse mudelite loomine (inimeste pärilikud haigused, vähimudelid jm);
- farmakoloogilised uuringud ja sihtmärkide valideerimine ravimiarenduses;
- põhi‑ ja translatsiooniline teadus: bioloogiliste teede kaardistamine;
- põllumajanduses ja biotehnoloogias: omaduste modifitseerimine läbi geenimuudatuste (siin sageli knock‑in‑lähenemisi kombineeritult).
Piirangud, ohud ja parimad praktikad
- geenide funktsioonide kompensatsioon — organism võib aktiveerida alternatiivseid geene, mis varjavad knock‑out efekti;
- embrüonaalne letalsus — mõnede geenide täielik kaotus põhjustab arengukatkestuse, mistõttu kasutatakse koe‑spetsiifilisi või induseeritavaid lähenemisi;
- off‑target efektid — eriti CRISPR puhul tuleb kontrollida mittesihtotstarbelisi muutusi ja teha kontrollisendid;
- mosaiksus ja alatõenäosus — üksikisendi genotüüpi tuleb põhjalikult karakteriseerida; sageli tehakse mitu sõltumatut klooni/isendit;
- eksperimentaalne kontroll — soovitatav on teha rescue-katseid (näiteks restoresioon funktsionaalse geeniga või knock‑in), et kinnitada fenotüübi seos sihtgeeniga;
- eetika ja regulatsioon — loomade kasutamine ja genoomimuutused on reguleeritud ning nõuavad heakskiite ja hoolikat eetilist kaalutlemist.
Erinevus knockout ja knockdown vahel
Oluline on eristada knockout (geen täielikult või püsivalt inaktiveeritud) ja knockdown (geeniekspressiooni ajutiselt või osaliselt vähendatud, nt RNAi kaudu). Knockout annab tavaliselt selgema fenotüübi, kuid võib olla keerulisem ja tekitada arengutõrkeid.
Kokkuvõte
Geeni knockout on võimas tööriist geneetikas ja biomeditsiinis geeni funktsiooni määramiseks ja haiguse mehhanismide uurimiseks. Tänapäevased tehnoloogiad nagu CRISPR on kiirendanud võimalusi, kuid nõuavad hoolikat planeerimist, kontrollide kasutamist ning eetilist ja regulatiivset vastavust. Knock‑in meetodid täiendavad tööriistakomplekti, võimaldades geeni asendamist või täiendamist konkreetsete märgiste ja parandustega.
Meetod
Knockout saavutatakse mitmete tehnikate kombinatsiooni abil. See algab katseklaasis plasmiidi või muu DNA-konstruktsiooniga ja jätkub rakukultuuriga.
Üksikud rakud on geneetiliselt muundatud DNA-konstruktsiooniga. Sageli on eesmärk luua loom, kellel on muudetud geen.
Kui see on nii, siis embrüonaalsed tüvirakud on geneetiliselt muundatud ja sisestatud varajastesse embrüotesse. Saadud loomad, kelle sugurakkudes on geneetiline muudatus, võivad seejärel sageli edasi anda geenilõikuse tulevastele põlvkondadele.
Küsimused ja vastused
K: Mis on geeni väljalangemine?
V: Geeni knockout on geneetiline meetod, mille puhul üks organismi geenidest lülitatakse välja või asendatakse sellega, mis ei tööta.
K: Miks kasutatakse knockout-hiiri?
V: Knockout-hiirte kasutatakse selleks, et õppida tundma geeni, mis on sekveneeritud, kuid mille funktsioon on teadmata või puudulikult teada.
K: Mida saavad teadlased järeldada knockout-organismide ja normaalsete isendite erinevusest?
V: Teadlased saavad teha järeldusi knockout-organismi ja normaalsete isendite erinevusest.
K: Mis on knockout'i lühend?
V: Knockout'i lühend on KO.
K: Mis on geeni knock-in?
V: Geeni knock-in on geenide knockout'i vastand, kus geen lülitatakse sisse või lisatakse toimiv geen.
K: Mille poolest erineb geen knock-in geeni knockoutist?
V: Geeni knock-in on vastupidine geeni knock-out'ile; kui geeni knock-out lülitab välja või asendab mittetöötava geeni, siis geeni knock-in lisab toimiva geeni.
K: Mis on knockout- või knock-in-tehnika kasutamise eesmärk?
V: Knockout- või knock-in-meetodite kasutamise eesmärk on saada rohkem teada nende geenide funktsioonist, mis on küll sekveneeritud, kuid mida ei ole veel täielikult mõistetud.