Transformatsioon (geneetika): DNA ülevõtmine bakterites ja transfektsioon eukarüootides

Molekulaarbioloogias on transformatsioon raku geneetiline muundamine DNA otsese ülevõtmise ja ekspressiooni teel raku ümbritsevast keskkonnast.

Transformeerumine toimub mõnedes bakteriliikides looduslikult ja seda saab teha ka kunstlikult. Baktereid, mis on võimelised transformeeruma, kas siis looduslikult või kunstlikult, nimetatakse pädevateks.

Transformatsioon on üks kolmest protsessist, mille abil saab bakterirakkudesse viia väljastpoolt pärit geneetilist materjali. Teised kaks on konjugatsioon (geneetilise materjali ülekandmine kahe bakteriraku vahel otsekontaktis) ja transduktsioon (võõrliikide DNA süstimine bakteriofaagiga peremeesorganismi).

Transformatsiooni võib kasutada ka uue geneetilise materjali sisestamise kirjeldamiseks mittebakteriaalsetesse rakkudesse, näiteks looma- ja taimerakkudesse. Võõra DNA sisestamist eukarüootide rakkudesse nimetatakse tavaliselt "transfektsiooniks".

Transformatsiooni ja pädevuse mehhanism bakterites

Loosiseselt pädevad bakterid omavad spetsiifilisi valke ja transportmehhanisme, mis võimaldavad vaba DNA sidumist rakupinnal ning selle transporti periplasma või tsütoplasmasse. Paljudel liikidel on pädevus ajaliselt reguleeritud ja sõltub keskkonnamõjuritest (näiteks toitainete puudusest või raku tihedusest). Mõned tuntud näited looduslikust transformatsioonist on Streptococcus, Bacillus, Neisseria ja Acinetobacter.

Pärast DNA sisenemist võib see eksisteerida raku sees episoomina (nt plasmidina) või integreeruda kromosoomi homoloogilise rekombinatsiooni teel. Integreerumine sõltub DNA järjestuse sarnasusest peremehe genomiga ja raku rekombinatsioonisüsteemide aktiivsusest.

Kunstlikud meetodid bakterites

Laboritingimustes muudetakse baktereid sageli pädevaks, et tõsta DNA sisenemise efektiivsust. Levinud meetodid:

• Kemiline pädevus (nt CaCl2): rakumembraani läbitavust suurendatakse ioonilise keskkonna ja kuumashoki abil; ühine meetod Escherichia coli transformatsiooniks.
• Elektroporatsioon: lühike tugev elektrivõnke tekitab membraanil ajutisi porisid, mille kaudu DNA möödub; väga efektiivne nii plasmidi- kui ka genoomse DNA jaoks.
• Protoplastide sissetoomine: raku seina eemaldatakse ja DNA viiakse sissetöötatud protoplasti sisse, seejärel taastatakse rakusein.

Transformatsiooni efektiivsust mõõdetakse tavaliselt transformeeritud kolooniate arvuna per mikrogramm sisestatud DNA-d (transformatsioonitõhusus). Valikurohkeks kasutatakse selekteerivaid markereid (nt antibiootikumiresistentsuse geenid) või reporterite (nt GFP), et tuvastada transformante.

Transfektsioon eukarüootides

Eukarüootsete rakkude puhul kasutatakse termineid transfektsioon (mittevirootiline DNA/RNA sisestus) ja transduktsioon/transfektsiooniga seotud viirusvektorid viroatiliseks geeniülekandeks. Peamised transfektsioonimeetodid:

• Lipofektsioon (liposoomid, kationilised lipiidid): DNA/RNA pakendatakse lipiidmullikestesse, mis konjugeeruvad rakumembraaniga ja vabastavad geneetilise materjali.
• Elektroporatsioon: kasutatakse nii primaarsete rakkude kui ka rasketüübiga kultuuride puhul.
• Füüsikalised meetodid: mikro-injektsioon (otsene DNA süstimine tuuma), biolistika (tuntud kui "gene gun" taimerakkudes), ja sferoplastidega töötlemine.
• Vektorpõhised meetodid: viirusvektorid (adenoviirus, lentiviirus, AAV jpt) võimaldavad efektiivset ülekannet ja sageli püsivat integreerumist või kõrget episoomset ekspressiooni.
• Polümeerid ja nanomaterjalid: PEI, polüetiüleenoksiid, ja mitmed lipiid-nanoosakesed on samuti laialdaselt kasutusel.

Transfektsiooni tulemuseks võib olla ajutine (transientne) ekspressioon või püsiv (stabiilne) integratsioon genoomi kaudu. Püsivaid siirdeid valitakse korduvate selekteerimissammudega (antibiootikumid, auxotroopsed markereid), stabiilsuse kinnitamiseks kasutatakse PCR-, Southern- või järjestusanalüüse.

Rakendused

• Geneetiline kloonimine ja rekombinantne valguekspressioon (plasmidid bakterites või eukarüootsetes rakusüsteemides).
• Genoomi redigeerimine koos CRISPR/Cas-süsteemidega, kus DNA või gRNA viiakse rakkudesse transformatsiooni/transfektsiooni teel.
• Vaktsiinide ja terapeutiliste valkude tootmine ning geneetilise teraapia uurimine (viirusvektorid/transfektsioon).
• Uurimistöö basiilistes protsessides, geenifunktsiooni määramine ja regulatorsete elementide analüüs.
• Taime- ja loomaparenduse biotehnoloogilised rakendused (nt Agrobacterium-vahendatud geenisiirded ja biolistika taimedesse).

Ajalooline taust

Transformatsiooni nähtust esimesena kirjeldas Frederick Griffith 1928. aastal pneumokokkide katsetes (nn Griffithi eksperiment). Aastaid hiljem (1944) näitasid Avery, MacLeod ja McCarty, et transformatsiooni "muundav aine" on DNA, mis oli oluline samm DNA rolli tunnustamisel pärilikkuse kandjana.

Turvalisus ja eetika

Transformatsiooni ja transfektsiooni laboritingimustes tuleb järgida bioohutuse ja biokindluse reegleid, sest geneetiliselt muundatud organismid võivad kanda uusi fenotüüpe (nt antibiootikumiresistentsus). Töös riskirühmadega ja kliinilistes rakendustes kehtivad ranged regulatsioonid ja eetikastandardid.

Kokkuvõte

Transformatsioon bakterites ja transfektsioon eukarüootides on võimsad tööriistad molekulaarbioloogias ja biotehnoloogias, mis võimaldavad suunatud geneetilist muutmist, valkude tootmist ja teaduslikke uuringuid raku tasandil. Meetodite valik sõltub sihtrakust, eesmärgist (ajutine vs stabiilne ekspressioon) ning ohutusnõuetest.

Küsimused ja vastused

K: Mis on transformatsioon molekulaarbioloogias?

K: Milliste bakteriliikide puhul toimub transformatsioon looduslikult?

K: Kuidas nimetatakse baktereid, mis on võimelised transformeeruma?

K: Millised on lisaks transformatsioonile veel kaks protsessi, mille abil saab bakterirakkudesse tuua väljastpoolt pärit geneetilist materjali?

K: Kas transformatsiooni saab teha kunstlikult?

K: Mis on transfektsiooni mõiste?

K: Kuidas erineb transduktsioon transformatsioonist?

Otsing