Transfektsioon: definitsioon, meetodid ja rakendused (DNA/RNA)
Transfektsioon: definitsioon, DNA/RNA meetodid ja rakendused — tehnoloogiad, protokollid, geeniteraapia, koekultuurid, riskid ja praktilised juhised.
Transfektsioon on protsess, mille käigus viiakse rakkudesse tahtlikult DNA või RNA. Sõna moodustub transformeerimisest ja nakatumisest. Terminit kasutatakse:
- Bakterirakkude transformeerimine viirusliku nukleiinhappega
- Loomade rakkude transformeerimine koekultuuris puhastatud DNA-ga. DNA lisatakse rakkude genoomile.
- Rakkude või embrüote transformeerimine ühe- või kahesuunalise RNA-ga. See põhjustab teatavate valkude ehitamist või teatavate geenide vaigistamist.
- Geeniteraapia, milles kasutatakse muundatud viirust vektorina.
Transfektsioon võib põhjustada sihtrakkudes ootamatuid morfoloogiaid ja kõrvalekaldeid. RNA-molekulide transfektsioon põhjustab muutusi, mis ei saa püsivalt edasi kanduda rakuliinis.
Mida transfektsioon täpsemalt tähendab
Transfektsioon hõlmab geneetilise materjali (DNA, mRNA, siRNA, shRNA jt) sisenemist rakkudesse eesmärgiga muuta geeniekspressiooni, uurida geenifunktsioone või toota valke. Kui kasutatav nukleiinhape integreerub raku genoomi või säilib plasmiidina, võib toime olla püsiv (stable). Kui nukleiinhape on ajutiselt rakkudes ja kaob rakujagunemise käigus, nimetatakse seda ajutiseks (transient) transfektsiooniks.
Peamised transfektsioonimeetodid
Meetodid jagunevad kolme suurde rühma: keemilised, füüsikalised ja bioloogilised. Igal meetodil on enda tugevused ja piirangud sõltuvalt rakutüübist ja eesmärgist.
- Keemilised meetodid: lipiidipõhised transfecting-agentid (lipofektsioon), kaltsiumfosfaat, DEAE-dextran jt. Lipofektsioon on laialdaselt kasutatav koekultuurides, kuna see on suhteliselt madala toksilisusega ja tõhus paljudes rakkudes.
- Füüsikalised meetodid: elektroporoatsioon (elektrilained avavad raku- ja tuuma membraanid), mikroinjektsioon (otsene süstimine rakkude või emakatta tuuma), gene gun (kuld- või titaaniosakeste kiiritus) ja sonoporation (ultraheli abil permeaabluse suurendamine). Need sobivad sageli rakkudele, mida keemilised meetodid ei pärsi, näiteks primaarrakud või taimarakud.
- Bioloogilised meetodid: viral vectorid (adenoviirus, lentiviirus, AAV jt) — väga tõhusad rakkudesse sisenemisel ja tihti kasutusel nii uurimuses kui ka geeniteraapias. Viraliseerimine ehk transduktsioon erineb tehniliselt transfektsioonist, kuid igapäevases keelepruugis nimetatakse neid vahel kattuvateks mõisteteks.
DNA vs RNA transfektsioon — erinevused ja rakendused
DNA-transfektsioon kasutatakse tavaliselt geeniekspressiooni kauemaks muutmiseks, rekombinantsete valkude tootmiseks või stabiilsete rakkude loomiseks (nt selekteeritavad markerid ja integraatorid). RNA-transfektsioon (nt mRNA, siRNA, shRNA) põhjustab kiiret, kuid ajutist muutust valgutasemetes või geeniekspressioonis — see sobib kiireks funktsiooni testimiseks, valgu ekspresseerimiseks ilma genoomi muutmata või RNAi-põhiseks geenivaigistamiseks. Näiteks mRNA-transfektsioon oli oluline osa mRNA vaktsiinide arendamises.
Transientne vs stabiilne transfektsioon
Transientne transfektsioon: nukleiinhape ei integreeru genoomi, proteiini toodang kestab mõnest tunnist mitme päevani. Kasutatakse valgu ekspressiooni ajutiseks uurimiseks või RNAi eksperimentideks. Stabiilne transfektsioon: DNA integreerub või püsib rakkudes selekteeritava plazmiidi kujul, võimaldades pikaajalist ekspressiooni ja tõelistest pärilikkuse muudatustest rääkida rakuliinidesse. Stabiilse rühma loomine nõuab selektsiooni (nt antibiootikum) ja klaonimist.
Rakutüüpide ja efektiivsuse kaalutlused
Transfektsiooni tõhusus sõltub oluliselt rakutüübist (immortaliseeritud rakkud, primaarrakud, tüvirakud, bakterid, taimerakud), nukleiinhappe tüübist, reaktsiooni tingimustest, dosisest ja transfecting-agendi valikust. Primaarrakud ja mõningad tüvirakud on sageli resistentsed ning nõuavad optimeerimist või tugevamaid meetodeid (nt elektroporoatsioon, viraliseerimine).
Kasutusalad
- Geenifunktsiooni uurimine (overekspressioon ja knockdown/knockout eksperimendid).
- Rekombinantsete valkude tootmine ja signaalirada-analüüs.
- CRISPR/Cas süsteemi kohaletoimetamine geeniredigeerimiseks.
- Geeniteraapia uurimine ja ravivõtete arendamine (viral vektorid, siRNA-ravimid).
- Vaktsiinide arendamine (nt mRNA vaktsiinid) ja immuunvastuse modelleerimine.
Ohutus, eetikaküsimused ja kontrollid
Transfektsioon võib põhjustada tsellulaarsest stressist tingitud morfoloogilisi muutusi, off-target efekte ja immunogeenseid vastuseid, eriti viraliseerimise või suurtel DNA-dosistel. Laboris tuleb järgida bioloogilise ohutuse juhiseid (sobiv biosafety level), kasutada asjakohaseid positiiv- ja negatiivkontrolle ning hinnata rakutoksilisust ja ekspressiooni taset. Eetiliselt on oluline eristada põhitööd ja kliinilist rakendust — geeniteraapia ja in vivo eksperimendid nõuavad rangeid regulatiivseid heakskiite.
Kuidas mõõta ja kinnitada transfektsiooni edukust
Tavapärased meetodid: reporter-geenid (GFP, luciferase), qPCR DNA/RNA tasemete määramiseks, Western blot või immunofluoresents valguekspressiooni kontrolliks ning funktsionaalsed testid rakutüüpidele spetsiifiliste omaduste hindamiseks. Lisaks kasutatakse selektsioonimarke (nt antibiootikumiresistentsus) stabiilsete rakkude valimiseks.
Nõuanded optimeerimiseks
- Alusta väikeste doosidega ja määra toksilisus enne suuremaid eksperimente.
- Testi erinevaid meetodeid ja reagensse konkreetse rakuliini jaoks.
- Kasutage ajutise ja püsiva ekspressiooni puhul sobivaid kontrolle.
- Dokumenteerige kogu töö, et tagada reprodutseeritavus ja turvalisus.
Kokkuvõtlikult on transfektsioon mitmekülgne ja võimas tööriist molekulaarbioloogias ja biomeditsiinis. Õige meetodi ja hoolika optimeerimisega võimaldab see uurida geenide funktsioone, toota valke, arendada ravimeetodeid ja viia läbi keerukaid geneetilisi manipulatsioone, samas kaasnevad selle kasutusega teaduslikud ja eetilised kohustused.
DNA-konstruktsioonid
DNA-konstruktsioon on kunstlikult konstrueeritud nukleiinhappe osa, mis "siirdatakse" sihtkoesse või -rakkudesse. See võib sisaldada DNA-inserti, mis sisaldab huvipakkuvat valku kodeerivat geenijärjestust.
DNA insert on molekulaarbioloogilise vektori süda. See on üldnimetus vahendile, mida kasutatakse võõra geneetilise materjali ülekandmiseks teise rakku. Loomsete rakkude transfektsioon hõlmab tavaliselt ajutiste pooride (aukude) avamist rakumembraanis, et rakud saaksid vektori vastu võtta.
Küsimused ja vastused
K: Mis on transfektsioon?
V: Transfektsioon on DNA või RNA tahtlik sissetoomine rakkudesse.
K: Kuidas moodustub mõiste "transfektsioon"?
V: Termin "transfektsioon" moodustub sõnadest "transformatsioon" ja "nakkus".
K: Millised on transfektsiooni erinevad liigid?
V: Transfektsiooni erinevad liigid on järgmised: bakterirakkude transformeerimine viirusliku nukleiinhappega, loomsete rakkude transformeerimine koekultuuris puhastatud DNA-ga, rakkude või embrüote transformeerimine ühe- või kahesuunalise RNA-ga ja geeniteraapia, mille puhul kasutatakse muundatud viirust vektorina.
K: Mis juhtub, kui DNA lisatakse rakkude genoomi transfektsiooni käigus?
V: Kui DNA lisatakse transfektsiooni käigus rakkude genoomile, võib see põhjustada teatud valkude ehitamist või teatud geenide vaigistamist.
K: Kas RNA-molekulidega transfektsiooni teel tekitatud muutused võivad püsivalt edasi kanduda rakuliini?
V: Ei, RNA-molekulidega transfektsiooni teel tekitatud muutusi ei saa püsivalt edasi kanda rakuliinis.
K: Mida võib transfektsioon põhjustada?
V: Transfektsioon võib põhjustada sihtrakkudes ootamatuid morfoloogiaid ja kõrvalekaldeid.
K: Mis on geeniteraapia eesmärk, kasutades muundatud viirust vektorina?
V: Geeniteraapia eesmärk, mille puhul kasutatakse muundatud viirust vektorina, on viia geneetilise haigusega inimese genoomi uusi, funktsionaalseid geene, lootuses seda haigust parandada või ravida.
Otsige