Genoomi redigeerimine: meetodid, rakendused ja eetika

Genoomi redigeerimine on üks geenitehnoloogia liike, mille abil muudetakse organismi pärilikku materjali sihipäraselt ja täpselt.

Kuidas see töötab

DNA sisestatakse, asendatakse või eemaldatakse genoomist kunstlikult loodud nukleaaside ehk „molekulaarsete kääride“ abil. Need ensüümid lõikavad DNA-d soovis kohas, tekitades genoomis spetsiifilisi kahesoonelisi katkestusi (double-strand breaks, DSB).

Raku enda parandussüsteemid reageerivad tekkinud katkestustele peamiselt kahel viisil:

• NHEJ (non-homologous end joining) – puhastab ja liidab DNA otstele kiiresti, kuid see protsess on vigadele altim ning võib põhjustada insertse või deletsioone (indele), mille tulemusena vallandub geenide funktsiooni kaotus.
• HDR (homology-directed repair) – kasutab sarnast DNA-molekuli mallina ja võimaldab sihipärast geenijärjestuse asendamist, kui koos lõikega on raku kätte antud sobiv mall.

Tänapäevased tehnoloogiad ei piirdu ainult DSB-põhise muutmisega: arendatud on ka baasi redigeerimine (base editing), mis muudab üksikuid nukleotiide ilma kahesoonelisi lõikeid tegemata, ja prime editing, mis võimaldab keerukamaid järjestusevahetusi kõrgema täpsusega.

Peamised meetodid

Praegu on kasutusel neli peamist perekonda muudetud nukleaase ja sellega seotud lähenemisi:

• Meganukleaasid – looduslikud või muudetud ensüümid, mis tunnevad ära väga pikki ja spetsiifilisi sihtjärjestusi.
• ZFN (Zinc Finger Nucleases) – kinnituvad DNA-le läbi tsink-sõrmede ja lõikavad liitunud „kääride“ abil, võimaldades redigeerimist ka kohtades, mida teised meetodid ei pruugi sihtida.
• TALENid – valgustruktuurid, mis kodeerivad järjestuse spetsiifilisust aminohapete kaudu, olles modulaarsed ja kohandatavad.
• CRISPR–Cas süsteemid – RNA juhitud endonukleaasid (nt Cas9), mis on lihtsad, odavad ja väga tõhusad ning on viimase aastakümne jooksul muutnud genoomi redigeerimise laialdaselt kättesaadavaks.

Rakendused

Genoomi redigeerimist kasutatakse mitmel alal:

• Põhi- ja biomeditsiiniline uurimus: geeni või Geeni funktsiooni mõistmiseks muudetakse järjestusi ja jälgitakse mõju rakkudele, kudedele või organismile; see aitab luua haiguse mudeleid ja avastada ravivõimalusi.
• Geneetilised haiguste ravimeetodid: somaatilised geeniteraapiad, kus muutus tehakse patsiendi kehakoes (nt veres, maksas või silmas), et parandada funktsiooni või kõrvaldada defekt.
• Põllumajandus ja biotehnoloogia: taimed ja loomad, mille genomit on muudetud vastupidavuse, toiteväärtuse või tootlikkuse parandamiseks.
• Ravimitootmine ja biotehnoloogilised tooted: tootmine kõrgema puhtuse või saagikusega valgud ja ained.

Meetodid geenifunktsiooni uurimisel ja alternatiivid

Sageli sekkutakse järjestusspetsiifiliselt, et mõista valgu või geeni rolli. Mõnel juhul on kohaspetsiifiline mutatsioon tehniliselt keerukas või võimatu, mistõttu kasutatakse ka kaudsemaid meetodeid. Näited:

• Huvipakkuva geeni vaigistamine lühikese RNA-interferentsi (siRNA) abil. Siiski võib siRNA abil toimuv geenide häirimine olla varieeruv ja ebatäielik.
• Genoomi redigeerimine nukleaasidega, nagu ZFN, TALENid või CRISPR–Cas, võimaldab teostada püsivaid ja täpsemaid muudatusi kui traditsiooniline RNA-interferents. Töödeldud nukleaasid saavad lõigata DNA-d ja seeläbi muuta geenijärjestusi kohtades, mida tavapärase RNAi abil ei ole võimalik spetsiifiliselt sihtida.

Ohud, piirangud ja tehnilised probleemid

• Off-target efektid: ensüümid võivad lõigata ka mittesihtkohti, põhjustades soovimatuid mutatsioone.
• Mosaiiksus: varases embrüofaasides tehtud muudatused võivad avalduda ainult osa rakkudes, mis raskendab prognoositavat tulemust.
• Tarnimise raskused: muundatud nukleaaside või redigeerimismallide viimine õigesse kudesse on tehniliselt keeruline (nt viirusvektorid, lipiidnanopartikelid, elektroporatsioon).
• Pikaaegsed tagajärjed ja immunogeensus: ravivastused ja võimalik immuunsus ensüümidele või vektoritele vajavad hoolikat hindamist.

Eetika ja regulatsioon

Genoomi redigeerimine tõstatab olulisi eetilisi, õiguslikke ja sotsiaalseid küsimusi. Eriti tundlik on jutt genoomi muutmisest sugurakkudes või varases embrüos (germline editing), kuna sellised muutused päranduvad järgmiste põlvkondade kaudu. Avalik ja teaduslik debatt keskendub järgmistele teemadele:

• isikute nõusolek ja tulevaste põlvkondade õigused;
• võimalik ebaõiglane ligipääs või „disainitud“ omaduste kasutuselevõtt;
• rahvusvaheline regulatsioon ja järelevalve ning standardid ohutuse ja efektiivsuse hindamiseks;
• vastutus ja riskide hindamine, sh patsiendiohutuse tagamine kliinilistes uuringutes.

Nature Methods valis genoomi redigeerimise 2011. aasta meetodiks. Seda tehnikat juba kasutatakse teadusuuringutes ja somaatilistes raviuuringutes, kuid muudetud embrüote siirdamine naisele ei ole veel lubatud enamikus riikides ning germline-redigeerimise kohta kehtivad ranged moratooriumid ja eetikasoovitused.

Lõppsõna

Genoomi redigeerimine on võimas tööriist, mis pakub suuri võimalusi meditsiinis, põllumajanduses ja teadusuuringutes. Samas nõuab selle ohutu ja õiglane kasutamine tugevat teaduslikku kontrolli, rahvusvahelist koostööd ning läbimõeldud eetilisi ja õiguslikke raamistikke. Tehnoloogia areng toob kaasa uusi meetodeid (nt baasi- ja prime-redigeerimine), mis vähendavad teatud riske, kuid põhiteemad — ohutus, õiglus ja jätkusuutlik regulatsioon — jäävad jätkuvalt aktuaalseks.

Küsimused ja vastused

K: Mis on genoomi redigeerimine?

K: Kuidas kasutatakse genoomi redigeerimisel tehislikke nukleaase?

K: Millised on mõned näited kaudsetest meetoditest, mida kasutatakse geenide funktsiooni mõistmiseks?

K: Miks valiti genoomi redigeerimine Nature Methods'i 2011. aasta meetodiks?

K: Kas genoomi redigeerimiseks saab kasutada eri tüüpi muundatud nukleaase?

K: Mille poolest erineb siRNA teistest meetoditest geenide funktsiooni mõistmiseks?

K: Kas muundatud embrüote siirdamine naisele on praegu lubatud?

Otsing