ELISA (immunoensüümmeetod) — põhimõte ja kasutusalad

ELISA (immunoensüümmeetod) — tundlik ja spetsiifiline meetod antigeenide/tsütokiinide tuvastamiseks; põhimõte, tööpõhimõte ja praktilised kasutusalad diagnostikas ja teadusuuringutes.

ELISA-meetod (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay) on biokeemias ja molekulaarbioloogias laialt kasutatav analüüsimeetod, mille abil määratakse, kas ja kui palju teatud ainet — näiteks konkreetset tsütokiini või antigeen - — on proovist leitav. Meetodit lühendatakse mõnikord ka kui "EIA".

Põhimõte lühidalt

ELISA põhineb antikehade ja antigeenide spetsiifilisel seondumisel. Proovi lisamisel seonduvad sihitud molekulid tahke aine (tavaliselt polüstüreeni 96‑auguline plaat) pinnale kinnitatud «püüdjaga» või otsese antikehaga. Sidumisjärgselt lisatakse ensüümiga konjugeeritud tuvastusantikeha või konjugeeritud ligand, mis katalüüsib värvimuutuse tekitava substraadi muundamise. Värvuse intensiivsus on proportsionaalne sihitud aine hulga või vastupidiselt sellest, sõltuvalt ELISA tüübist, ning seda mõõdetakse spektromeetriga (optimaalne lainepikkus sõltub substraadist, nt 450 nm TMB puhul pärast peatamist).

Peamised sammud

• Kattumine — plaat kaetakse kas antigeeni või «capture» antikehaga.
• Blokeerimine — vabanud pinnad blokeeritakse (nt BSA, piimapulber), et vähendada mittespetsiifilist seostumist.
• Proovi lisamine — proov (serum, rakukultuuride supernataant jms) lisatakse ja inkubeeritakse, et sihtmolekul seonduks.
• Pesud — mitmekordsed pesud bufferiga eemaldavad mittespetsiifiliselt seondunud komponendid.
• Tuvastusantikeha lisamine — antikeha, mis on seotud ensüümiga (nt HRP — horseradish peroxidase või AP — alkaline phosphatase), lisatakse ja inkubeeritakse.
• Substraadi lisamine — ensüümi substraat (nt TMB, OPD, PNPP) põhjustab visuaalset värvimuutust või säramist (fluorestsentne/kemiluminestsentne variant).
• Mõõtmine — värvuse intensiivsus mõõdetakse plaatlugeriga. Kvantitatiivseks määramiseks kasutatakse standardkõverat tuntud kontsentratsioonidega standarditest.

Tüübid

• Direktne ELISA — märgistatud antikeha seondub otse sihtmolekulile; lihtne ja kiire, kuid vähem tundlik.
• Indirektne ELISA — esmase antikeha seondumise järel lisatakse märgistatud sekundaarne antikeha; suurendab signaali ja paindlikkust.
• Sandwich (kihiline) ELISA — kasutatakse kaheahelalist sidumist: üks „püüdja” antikeha immobiliseeritakse, proovi järel seondub sihtmolekul ja sellele järgneb märgistatud tuvastusantikeha; väga spetsiifiline ja tundlik, sobib suuremate molekulide jaoks.
• Konkurentsiline ELISA — tuntud kogus märgistatud antigeeni konkureerib proovi antigeeniga piiratud antikeha sidumiskohtade pärast; sobib väikeste molekulide (nt hormoonide, ravimijääkide) määramiseks.

Tuvastussüsteemid ja ensüümid

Levinumad ensüümid on HRP (horseradish peroxidase) ja AP (alkaline phosphatase). Levinud substraadid: TMB (HRP jaoks, annab sinaka värvuse, mida peatamisel loetakse 450 nm), OPD ja PNPP (AP jaoks). Lisaks värvile on laialdaselt kasutusel ka fluorestsentse ja kemiluminestsentseid süsteeme, mis suurendavad tundlikkust ja dünaamilist ulatust.

Rakendused

• Diagnostika: nakkushaiguste seroloogia (näiteks HIV, hepatiit), autoimmuunhaiguste markerid.
• Uuringud: tsütokiinide ja teiste signaalmolekulide kvantifitseerimine rakkude kultuurist või patsientide proovidest.
• Hormoonide (näiteks insuliin, kilpnäärme hormoonid) ning ravimijääkide määramine.
• Toiduohutus ja allergia testid, veterinaarne diagnostika.
• Vaccine response monitoring ja immuunvastuse analüüs.

Eelised ja piirangud

• Eelised: suhteline kiirus, kõrge läbilaskevõime (multiwell plaadid), hea tundlikkus ja spetsiifilisus (eriti sandwich ELISA), võimalus kvantitatiivseks mõõtmiseks.
• Piirangud: võimalikud mittespetsiifilised seondumised ja matriksiefektid, ristreaktiivsus sarnaste molekulidega, nõuab head standardiseerimist ja kontrollide kasutamist. Väga kõrgete kontsentratsioonide korral võib esineda „hook effect” (prozone), mis alahindab tegelikku kontsentratsiooni.

Kvaliteedikontroll ja andmete tõlgendamine

Usaldusväärsete tulemuste saamiseks tuleb kasutada positiivseid ja negatiivseid kontrolle ning standardeid, korrata pesusid ja inkubatsioone nõuetekohaselt ning koostada standardkõver. Oluline on arvestada proovide töötlemise tingimusi, dilutsioone ja potentsiaalseid inhibiitoreid proovis (nt hemolüüs, lipemia).

Seos ELISPOT-meetodiga

ELISA põhjalikud põhimõtted on aluseks ka ELISPOT‑meetodile, mis on keerukam ja sageli tundlikum tehnika, mida kasutatakse üksikute rakkude tasemel toodetud valkude (nt tsütokiinide) tuvastamiseks. ELISPOT võimaldab kvantifitseerida reaktiivsete rakkude arvu, mitte ainult tsütokiini kontsentratsiooni proovis.

Kokkuvõttes on ELISA paindlik ja laialdaselt kasutatav meetod nii põhi‑ kui ka kliinilises teadustöös, kuid täpsus sõltub hoolikast proovi ettevalmistusest, sobivast ELISA tüübist ja range kvaliteedikontrolli järgimisest. Lisaks kasutatakse hästitöötatud ELISA-protokolle sageli koos teiste meetoditega parema valideerimise ja täpsuse tagamiseks.

Märkus: ELISA tulemuste tõlgendamisel järgige alati labori standardoperatsioonijuhendeid ja tootja juhiseid kasutatavate reagentide ja kitide kohta.

Küsimused ja vastused

K: Mis on ELISA?

K: Kuidas ELISA töötab?

K: Milliseid aineid saab ELISA-meetodiga tuvastada?

K: Mida näitab ELISA abil tekitatud värvuse kogus?

K: Kas ELISA on ainus meetod, mida kasutatakse konkreetsete ainete avastamiseks proovis?

K: Milline on ELISA-s kasutatava teise antikehade komplekti roll?

K: Kas ELISA tekitab alati värvi, kui aine avastatakse?

Otsing