Molekulaarne kloonimine: rekombinantse DNA koostamine ja paljundamine

Molekulaarne kloonimine: selgitus rekombinantse DNA koostamisest, vektorite ja peremeesorganismide rollist ning DNA paljundamise meetoditest koos praktiliste näpunäidetega.

Molekulaarkloonimine on üks molekulaarbioloogiatööde liik. Seda kasutatakse rekombinantsete DNA-molekulide koostamiseks ja nende paljundamise suunamiseks peremeesorganismides. Sõna kloonimine tähendab, et ühest elusrakust pärit DNA-molekuli kasutatakse selleks, et luua suur populatsioon rakke, mis sisaldavad identseid DNA-molekule. Molekulaarsed kloonimismeetodid on kesksel kohal paljudes tänapäeva bioloogia ja meditsiini valdkondades.

Molekulaarses kloonimises kasutatakse tavaliselt kahe erineva organismi DNA järjestusi: liik, mis on kloonitava DNA allikas, ja liik, mis on rekombinantse DNA paljundamiseks (replitseerimiseks) elava peremeheks.

Molekulaarse kloonimise eksperimendis saadakse kloonitav DNA huvipakkuvast organismist, seejärel töödeldakse seda katseklaasis ensüümidega, et saada väiksemaid DNA-fragmente. Seejärel ühendatakse need fragmendid vektor-DNAga, et toota rekombinantseid DNA-molekule. Seejärel viiakse rekombinantset DNAd peremeesorganismi (tavaliselt kergesti kasvatatav, healoomuline E. coli bakterite laboratooriumitüvi). Nii tekib organismide populatsioon, milles rekombinantse DNA molekulid paljunevad koos peremees-DNAga. Kuna need sisaldavad võõraid DNA-fragmente, on need "transgeensed" või geneetiliselt muundatud mikroorganismid (GMO).

See protsess kasutab ära asjaolu, et ühte bakterirakku saab sundida üles võtma ja paljundama ühte rekombinantset DNA-molekuli. Seda üksikut rakku saab seejärel eksponentsiaalselt laiendada, et luua suur hulk baktereid, millest igaüks sisaldab koopiaid algsest rekombinantsest molekulist. Seega nimetatakse nii saadud bakteripopulatsiooni kui ka rekombinantset DNA-molekuli tavaliselt "kloonideks". Rangelt võttes viitab rekombinantsed DNAd DNA-molekulidele, samas kui molekulaarne kloonimine viitab eksperimentaalsetele meetoditele, mida kasutatakse nende kokkupanekuks.

Peamised sammud ja tööriistad

Molekulaarkloonimise tavapärane töövoog sisaldab järgnevaid põhietappe:

• DNA eraldamine ja eesmärgi määratlemine – huvipakkuv geen või DNA-fragment puhastatakse organismist (genoomne DNA või cDNA).
• Fragmenteerimine ja lõikamine – kasutatakse restriktaase (restriktsioonendonukleaasid) või PCR-i, et saada sobiva pikkusega DNA-fragment.
• Vektori valik ja ettevalmistus – vektoriks võivad olla plasmidid, bakteriofaagid, cosmids, BAC või YAC sõltuvalt sisestuse suurusest ja peremeest.
• Ligatsioon või liitmine – DNA-fragment liidetakse vektoriga ensüümi (nt DNA-ligaza) või taanduvate kloonimismeetodite abil (nt Gibson-assembly, Golden Gate).
• Transformatsioon või transduktsioon – rekombinantne vektor viiakse peremeesrakku (nt E. coli) kasutades kuumutamis- või elektroporatsioonimeetodeid, või faagivahelist ülekannet.
• Valik ja sõelumine – kasutatakse selektsioonimarkerit (nt antibiootikumiresistentsus) ja sõeluvaid meetodeid (nt blue-white screens, koloonia-PCR, restriktsioonianalüüs, järjestamine) sobivate kloonide identifitseerimiseks.

Olulised ensüümid ja meetodid

Restriktsioonendonukleaasid lõikavad DNA-d kindlatesse palindroomsetesse järjestustesse, võimaldades fragmente sobituda vektoriga. DNA-ligaza liidab kokku katkendid. Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) võimaldab sihtjärjestuse kiiret paljundamist ja modifitseerimist (nt lisada lõike- või järjestusmärgid primeritesse). Uuemad meetodid nagu Gibson assembly või Golden Gate võimaldavad mitme fragmendi samaaegset liitmist ilma traditsiooniliste restriktaasidega töötlemata.

Vektorid ja peremeesorganismid

• Plasmidid – väiksed ringikujulised DNA-molekulid, laialt kasutatavad geenide ekspressiooniks bakterites.
• Bakteriofaagid ja cosmids – sobivad suuremate fragmentide transportimiseks.
• Bakteriaalsete kunstlike kromosoomide (BAC) ja pärmimeele kromosoomide (YAC) – sobivad väga suurte DNA-fragmentide kloonimiseks.
• Peremeesrakud – E. coli on kõige sagedasem lihtsuse ja kiire kasvatamise tõttu, kuid kloonimist tehakse ka pärmides, taimedes, loomakultuurides ja metsikutest mikroorganismidest pärinevate süsteemidega, kui on vaja eraldi ekspressiooni- või funktsionaalseid uuringuid.

Valik ja sõelumine

Pärast transformatsiooni on oluline eraldada need rakud, mis on võtnud üles rekombinantse vektori. Tavaliselt kasutatakse:

• antibiootikumikindluse markereid (nt ampR, kanR),
• reporter-geene (nt lacZ blue-white skrining),
• koloonia-PCR-i või restriktsioonianalüüsi kiireks kontrolliks,
• ja lõplikuks kinnituseks DNA-järjestamist.

Rakendused

• rekombinantsete valkude tootmine (insuliin, kasvufaktorid, ensüümid),
• geenide funktsiooni uurimine ja mutatsioonianalüüs,
• diagnostilised meetodid ja vaktsiiniarendus,
• genetiliselt muundatud organismide (GMO) loomine põllumajanduses ja tööstuses,
• geeniteraapiaalased uuringud (kuid in vivo rakendused nõuavad ranget regulatsiooni ja ohutusnõudeid).

Turvalisus ja eetika

Molekulaarne kloonimine on võimas tööriist, kuid sellega kaasnevad bioohutuse ja -eetika küsimused. Laboritingimustes järgitakse tavaliselt biosafety tasemeid (BSL-1 kuni BSL-4), kasutades sobivaid biokontrolli meetodeid, jäätmekäitlust ja reguleeritud ligipääsu patogeensetele proovidetele. Teadustöös hinnatakse riske, piire ja võimalikke sotsiaalseid tagajärgi, eriti kui tegemist on looduslikes populatsioonidesse sattumise või inimeste tervisega seotud rakendustega.

Nõuanded praktikas

• vali sobiv vektor ja peremeesrakustik vastavalt sisendi suurusele ja eesmärgile;
• planeeri kontrollid (negatiivsed ja positiivsed) iga eksperimentaalse sammuga kinnitamiseks;
• kasuta mitmekordseid sõelumismeetodeid (selektor + sõelurid) vigade vähendamiseks;
• kinnita lõplikud kloonid järjestamisega enne edasist kasutamist;
• järgi kohalikku ja rahvusvahelist regulatsiooni ning bioohutuse juhiseid.

Kokkuvõte

Molekulaarkloonimine tähendab rekombinantsete DNA-molekulide valmistamist ja nende replitseerimist valitud peremeesorganismides. Meetodid on tänapäeva biomeditsiini ja biotehnoloogia aluseks, võimaldades geneetilist manipuleerimist, valkude tootmist ja uurimist. Samas nõuavad need meetodid teadlikku riskihindamist, korrektset eksperimentaalset planeerimist ning eetiliste ja ohutusstandardite järgimist.

Küsimused ja vastused

K: Mis on molekulaarne kloonimine?

K: Kuidas toimub molekulaarne kloonimine?

K: Mida need kloonid sisaldavad?

K: Kui palju bakterirakke saab sundida võtma ja paljundama ühte rekombinantset molekuli?

K: Mis juhtub, kui see üksik rakk replitseerub?

K: Kas "rekombinantse" ja "molekulaarse kloonimise" vahel on mingi erinevus?

Otsing