Selekteeritav marker: definitsioon, kasutus ja näited geenitehnoloogias

Tutvu selekteeritava markeriga: definitsioon, kasutus geenitehnoloogias, antibiootikumiresistentsuse roll, praktilised näited ja rakendused bakterites ning rakukultuurides.

Selekteeritav marker on reportergeen, mis viiakse rakku koos geeniinsertiga. See tähendab, et eksperimentaator saab öelda, et rakus on õige geen, sest marker on nähtav või tuvastatav. Selekteeritavad markerid võimaldavad eraldada või rikastada neid rakke, mis on edukalt omandanud soovitud geneetilise muutuse, ning vähendavad oluliselt taustategevust (rakud, kus transformatsioon ei õnnestunud).

Kõige sagedamini kasutatakse seda bakterite või rakukultuuride puhul. Selekteeritavad markerid näitavad transfektsiooni või muu võõra DNA rakku viimise protseduuri edukust. See on geenide sihitamise ja geenide knockout'i tehnika. Praktikas tähendab see tavaliselt seda, et pärast DNA sissetoomist kasvatatakse rakke selektiivsel söötmel või muul tingimusel, mis tapab või pärsib raku, kui sellel ei ole markerit.

Selekteeritavad markerid on sageli antibiootikumiresistentsuse geenid; bakterid, millele on tehtud protseduur võõrd DNA sisseviimiseks, kasvatatakse antibiootikumi sisaldaval söötmel. Antibiootikum lööb välja rakud, millel ei ole resistentset markerit. Need bakterikolooniad, mis suudavad kasvada, on edukalt vastu võtnud ja väljendanud sissetoodud geneetilist materjali. Sama põhimõtet kasutatakse ka eukarüootsetes rakukultuurides, kuid valitud antibiootikumid ja markergeenid on erinevad ning sõltuvad organismist ja eksperimendi eesmärgist.

Alternatiiviks selekteeritavale markerile on skriinitav marker, mis võimaldab uurijal eristada soovitud ja soovimatuid rakke, ilma et teised rakud hävitataks. Skriinitavad markerid (nt fluorestsentsvalke nagu GFP või ensüümid nagu β‑galaktosidaas) lubavad visuaalset tuvastust, kvantifitseerimist ja rakkude sorteerimist (näiteks FACS), kuid nõuavad tihti lisa-instrumente ja võivad anda taustsignaali.

Näited ja tüübid

• Antibiootikumiresistentsuse geenid bakterites: bla (ampitsilliinile resistentsus, beetalaktamaas), nptII (kanamütsiin/ neomütsiin), cat (kloramfenikoolile resistentsus), tetA (tetratsükliin). Need võimaldavad kasvatusel antibiootikumi sisaldaval söötmel selekteerida transformante.
• Valikmarkerid eukarüootsetes rakkudes: neo (G418/neomütsiin), puro (puromütsiinile resistentsus), hyg (hügramütsiin B), bsd (blasticidin). Need on levinud mammaliaalsete rakureadede stabiilse transfeektsiooni puhul.
• Auxotroofsused ja metaboolsed markerid: pärmides ja mõnes muus mudelis kasutatakse URA3, HIS3, LEU2 jms markereid, kus selektsioon põhineb kasvul puudulikus söötmes. Mõned süsteemid võimaldavad ka vastupidist (counter‑selection), nt URA3 selekteerimine 5‑FOA abil.
• Skriinitavad reporterid: GFP ja teised fluorestsentsvalgud, luciferase (valgusreaktsioon), β‑galaktosidaas (X‑gal sinine värvus). Need võimaldavad rakkude otse visualiseerimist ja näiteks FACS‑sortimist.
• Takistussüsteemid ja alternatiivid: antibiootikumi‑vaba valik kasutab näiteks toksiin/antitoksiin süsteeme, aminohapete/tellimise puudujääke või ekspressioonide regulatsiooni (operator‑repressor titration). Need aitavad vähendada antibiootikumiresistentsuse laialdajamise riski.

Töövoog ja praktiline kasutus

Tavapärane töövoog selekteeritava markeriga on järgmine:

• Valitakse sobiv marker vastavalt organismile ja eesmärgile (näiteks antibiootikum bakteritele, neo mammaliaalsetele rakkudele, auxotroofsed markerid pärmidele).
• Ligand või plasmid, mis sisaldab nii huvi geeni kui markerit, viiakse rakkudesse (transformatsioon, transfection, electroporation jms).
• Pärast taastumisaega rakke kasvatatakse selektiivsel söötmel või rakukeskkonnas, mis võimaldab ellu jääda ainult markeri kandjatel.
• Isolatsiooni järgselt tõendatakse integratsiooni või ekspressiooni PCRi, järjestuse, fenotüübi või muu sobiva analüüsiga.

Märkimisväärsed piirangud ja ohutusküsimused

Kuigi selekteeritavad markerid on teadustöö alusvahend, on oluline arvestada mitmete piirangutega:

• Antibiootikumiresistentsuse levik: markerite kasutamine võib suurendada ohtu, et resistentsusgeenid levivad mõnes keskkonnas, eriti tööstuslikus või kliinilises kontekstis. Selle tõttu kehtivad rangemad regulatsioonid ja sageli eelistatakse eemaldatavaid või antibiootikumi‑vabasid süsteeme.
• Taustresistentsus ja selektiivne rõhk: mõne raku populatsioonis võib esineda looduslikku resistentsust või mutatsioone, mis vähendavad valiku efektiivsust.
• Regulatoorsed ja eetilised küsimused: kliinilistes rakendustes ja GM‑produktide tootmisel eelistatakse markerivabu lõpptulemusi; seetõttu kasutatakse markerite eemaldamist enne lõpliku rakustruktuuri heakskiitmist.

Markerite eemaldamine ja markerivabad strateegiad

Markerite eemaldamiseks või vältimiseks kasutatakse mitmeid tehnikaid:

• Rekombinaasi süsteemid: Cre‑lox ja FLP‑FRT süsteemid võimaldavad markergeeni välja lõigata pärast integratsiooni, jättes vähe või üldse mitte jäänuseid.
• Transposoonid ja piggyBac: võimaldavad markerite eemaldamist positsioonispetsiifiliselt.
• Markerless editing: CRISPR/Cas‑põhised meetodid koos homoloogilise rekombinatsiooni või integreerimise strateegiatega võimaldavad teha muudatusi ilma püsiva selekteeritava markerita või kasutades ajutisi (transient) selektoreid.

Kokkuvõte

Selekteeritavad markerid on võimas tööriist geenitehnoloogias: need parandavad eksperimendi efektiivsust, võimaldades kiiresti eraldada edukad transformandid. Samas tuleb markerit valida hoolikalt vastavalt organismini, eksperimendi eesmärgile ja ohutusnõuetele. Kui võimalik, kaalutakse skriinitavaid markereid, antibiootikumi‑vabasid süsteeme või strateegiaid markeri hilisemaks eemaldamiseks, et minimeerida biosafety‑riske ja regulatiivseid takistusi.

Küsimused ja vastused

K: Mis on valitav marker?

K: Millist tüüpi rakkude puhul kasutatakse selekteeritavat markerit kõige sagedamini?

K: Mis on selekteeritavate markerite eesmärk?

K: Millise tehnika puhul kasutatakse selekteeritavaid markereid?

K: Mis on näide selekteeritavatest markeritest?

K: Kuidas toimib antibiootikumiresistentsuse geen selekteeritava markerina?

K: Mis on selekteeritava markeri alternatiiv?

Otsing