Suunatud evolutsioon
Suunatud evolutsioon (DE) on meetod, mida kasutatakse ensüümide tootmiseks tööstuslikel või meditsiinilistel eesmärkidel.
Meetodiks on valgu insener, mis jäljendab looduslikku valikut.
Põhiidee seisneb selles, et geen läbib korduvaid mutatsioonivoorusid, et luua variantide raamatukogu. Selektsiooniga isoleeritakse soovitud funktsiooniga geenid. Need on malliks järgmise vooru jaoks.
Seda võib teha in vivo (elusates bakterite või pärmi rakkudes) või in vitro (vabas lahuses või mikrotilkudes).
Suurema arvu mutantide katsetamine suurendab võimalust leida soovitud omadustega mutant.
In vivo evolutsiooni käigus transformeeritakse iga rakk (tavaliselt bakterid või pärmid) plasmiidiga, mis sisaldab erinevat variandiraamatukogu liiget. Ainult huvipakkuv geen erineb rakkude vahel, kõik muud geenid jäävad samaks.
Rakud ekspresseerivad valku kas oma tsütoplasmas või pinnal, kus selle funktsiooni saab testida. Selle formaadi eeliseks on omaduste valimine rakukeskkonnas, mis on kasulik, kui arendatud valku või RNAd tahetakse kasutada elusorganismides.
Kui DE tehakse ilma rakkudeta, kasutatakse in vitro transkriptsioonitõlgendust, et toota valke või RNA-d vabalt lahuses või kunstlike mikrotilkade sees. Selle eeliseks on see, et see võimaldab rohkem tingimusi (nt temperatuur, lahustid). Sellega saab ekspresseerida valke, mis oleksid rakkudele toksilised. Peale selle saab in vitro evolutsioonikatsete abil luua palju suuremaid raamatukogusid (kuni 1015), sest raamatukogu DNA-d ei pea rakkudesse sisestama. See piirab sageli seda, mida saab teha.
Näide suunatud evolutsioonist, võrreldes seda loodusliku evolutsiooniga. Sisemine tsükkel näitab suunatud evolutsioonitsükli kolme etappi, sulgudes on esitatud jäljendatud looduslik protsess. Välimine ring näitab tüüpilise eksperimendi etappe. Punased sümbolid tähistavad funktsionaalseid variante, kahvatud sümbolid tähistavad vähendatud funktsiooniga variante.
Pärilikkuse tagamine
Kui funktsionaalsed valgud on isoleeritud, on vaja, et nende geenid oleksid samuti, seega on vajalik genotüübi ja fenotüübi vaheline seos.
See võib olla kovalentne, kus mRNA geen on translatsiooni lõpus puromütsiini abil seotud valguga.
Alternatiivselt võib valku ja selle geeni hoida koos või emulsioonitilkades. Eraldatud geenijärjestused paljundatakse seejärel PCR-meetodil või transformeeritud peremeesbakterite abil. Järgmise mutageneesi vooru malliks võib kasutada kas üksikut parimat järjestust või järjestuste kogumit. Korduvad mitmekesistamise, valiku ja paljundamise tsüklid muudavad ensüümivariandid valikuprotsessiga sobivaks.
Ekspresseeritud valk võib olla kovalentselt seotud oma geeniga (nagu mRNA), vasakul, või panna sellega samasse kambrisse, paremal. Mõlemal juhul on valku kodeeriv geen isoleeritud.
Välja antud auhind
USA insener Frances Arnold on võitnud aastatuhande tehnoloogiaauhinna suunatud evolutsiooni teerajajana.
Küsimused ja vastused
K: Mis on suunatud areng?
V: Suunatud evolutsioon (DE) on meetod, mida kasutatakse ensüümide tootmiseks tööstuslikel või meditsiinilistel eesmärkidel. See on valkude muundamise vorm, mis jäljendab looduslikku valikut.
K: Kuidas toimib suunatud evolutsioon?
V: Suunatud evolutsioon toimib nii, et geen läbib korduvaid mutatsiooniringe, mille käigus luuakse variantide raamatukogu. Seejärel eraldatakse soovitud funktsiooniga geenid, mida kasutatakse järgmise vooru mallidena.
K: Kus saab suunatud evolutsiooni teha?
V: Suunatud evolutsiooni saab teha in vivo (elusates bakterite või pärmi rakkudes) või in vitro (vabalt lahuses või mikrotilkades).
K: Millised on suunatud evolutsiooni in vivo tegemise eelised?
V: Suunatud evolutsiooni tegemisel in vivo on eeliseks omaduste selekteerimine rakukeskkonnas, mis on kasulik, kui evolveeritud valku või RNA-d tahetakse kasutada elusorganismides.
K: Millised eelised on suunatud evolutsiooni tegemisel in vitro?
V: Suunatud evolutsiooni tegemisel in vitro on eeliseks see, et see võimaldab rohkem tingimusi (nt temperatuur, lahustid) ja see võimaldab ekspresseerida valke, mis oleksid rakkudele toksilised. Lisaks saab luua palju suuremaid raamatukogusid, sest DNA-d ei pea rakkudesse sisestama.
K: Mis piirab seda, mida saab teha in vitro eksperimendi käigus?
V: In vitro eksperimendi käigus tehtava töö piiriks on sageli see, kui palju DNAd tuleb rakkudesse sisestada.
